Automatisierte Analyse der Koloniebildung
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Hochdurchsatz-Mikroskopie
Automatisierte Analyse der Koloniebildung ERNEST HEIMSATH BIOTEK INSTRUMENTS – A PART OF AGILENT, WINOOSKI, USA
The colony formation assay evaluates the proliferative capacity of a single cell. For applications such as cancer drug screening, it is important to distinguish cells that retain this proliferative capacity from those that do not. Conventional analysis of this assay involves scoring and quantifying colonies in each well of a multi-well format manually by eye, limiting its throughput capabilities. We present an automated method for conducting and analyzing the colony formation assay in both a 6-well and 96-well microplate using the upright color brightfield imaging with a wide field of view. DOI: 10.1007/s12268-020-1494-z © Springer Verlag GmbH 2020
ó Der Koloniebildungsassay bestimmt die Proliferationsfähigkeit von Zellen und bildet einen wesentlichen Ansatz, mit dem in der Krebsforschung Therapeutika und Strahlendosis getestet werden können [1, 2]. Hierbei werden die Zellen so ausgesät, dass sie ausreichend Fläche zur Vermehrung haben ohne dabei mit den benachbarten Kolonien zu verwachsen (Abb. 1, [3, 4]). Die sich formenden adhärenten Kolonien werden nach der Behandlung fixiert, mittels Kristallviolett gefärbt und zumeist visuell quantitativ analysiert. Das ausschlaggebende Auswahlkriterium bildet dabei die Koloniegröße von mehr
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als 50 Zellen, welche durch die visuelle Analyse subjektiv und oft fehlerhaft eingeschätzt wird. Diese sehr zeit- und arbeitsintensive Analyse verhindert zudem die high throughput-Verfahren in Formaten größer als 12oder 24-Well-Platten.
Kalibrierung der Koloniegröße zur Zellzahl Um automatisiert quantitative Aussagen zur Koloniegröße treffen zu können, wurden Adenokarzinomzellkolonien (Caco2) und Zervixkarzinomzellkolonien (HeLa) mit Kristallviolett und Hoechst 33342 gefärbt. Dabei
wurden die fluoreszierenden Eigenschaften des Kristallvioletts zur Definition der Koloniefläche genutzt, während Hoechst zur Quantifizierung der Anzahl der Zellen innerhalb der Kolonie verwendet wurde (Abb. 2A und 2D, [5]). Für die Korrelation von Koloniefläche und Zellzahl wurde dann eine lineare Regression abgeleitet (Abb. 2B und 2E). Diese ermöglicht die Bestimmung der Fläche von Kolonien aus mindestens 50 Zellen (Abb. 2C und 2F) und somit die automatisierte Auswertung des Koloniebildungsassays.
Effekt von Doxorubicin auf die Koloniebildung Doxorubicin ist ein Chemotherapeutikum, das durch Interkalation der DNA das Fortschreiten der Topoisomerase II und schließlich die makromolekulare Biosynthese hemmt [6, 7]. Um den EC50-Wert von Doxorubicin zu bestimmen, wurden Caco2- sowie HeLa-Zellen mit einer Dichte von 200 Zellen/Well in 6-Well-Platten und 50 Zellen/Well in 96-WellPlatten ausgesät und für sieben Tage mit 0,01–1000 nM Doxorubicin bzw. DMSO als Kontrolle kultiviert. Während im 6-WellFormat die Konzentrationen in Triplikaten analysiert wurden, konnten im 96-Well-Format acht Replikate jeder Konzentration angefertigt werden. Die mit Krist
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