Schnellnachweis von SARS-CoV-2 mit recombinase polymerase amplification
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W I S S EN S CH AFT · ME TH ODE N
Nukleinsäureamplifikation
Schnellnachweis von SARS-CoV-2 mit recombinase polymerase amplification OLE BEHRMANN 1,2 , IRIS BACHMANN 1, FRANK HUFERT 1, GREGORY DAME 1 1 MEDIZINISCHE HOCHSCHULE BRANDENBURG THEODOR FONTANE (MHB), NEURUPPIN 2 PROFESSUR FÜR SENSOREN, INSTITUT FÜR MIKROSYSTEMTECHNIK (IMTEK), UNIVERSITÄT FREIBURG
The COVID-19 pandemic highlights the need for fast and simple assays for nucleic acid detection. As an isothermal alternative to RT-qPCR, we outline the development of a detection scheme for SARS-CoV-2 RNA based on reverse transcription recombinase polymerase amplification (RT-RPA) technology. RPA uses recombination proteins in combination with a DNA polymerase for rapid amplification of target DNA at a constant temperature (39–42 °C) within 10 to 20 minutes and can be monitored in real-time with fluorescent probes. DOI: 10.1007/s12268-020-1458-3 © Die Autoren 2020
ó Die derzeitigen Protokolle zur Diagnose von SARS-CoV-2-Infektionen beruhen auf der quantitativen reversen Transkriptions-PCR (RT-qPCR) für den Direktnachweis der viralen RNA [1]. PCR-basierte Methoden sind jedoch aufgrund des notwendigen energieintensiven Thermocyclings für schnelles und dezentrales Screening vor Ort schwierig umsetzbar. Alternativ sind seit einigen Jahren isotherme Verfahren – wie die loop-mediated isothermal amplification (LAMP) [2] oder die recombinase polymerase amplification (RPA) [3] – verfügbar, welche der PCR hinsichtlich Sensitivität und Spezifität gleichwertig sind. Diese Methoden erfordern keine hochentwickelten Thermocycling-Instrumente und beruhen auf enzymatischen Prozessen. Aufgrund ihres vergleichsweise einfachen Designansatzes, milder Prozesstemperatur (39–42 °C), einer rasanten Amplifikationsgeschwindigkeit (10–20 min.) und der Verfügbarkeit von Reagenzien in lyophilisierter Form sehen wir die RPA als vielversprechende isotherme Nukleinsäure-Nachweismethode für die Vor-Ort-Diagnostik (Point-of-Care-Testing, POCT) an. Aufbauend auf vorhergehenden Arbeiten, in welchen der Nachweis anderer Coronaviren wie MERSCoV [4] und Bovines Coronavirus (BCoV) [5] mittels RPA demonstriert wurde, stellen wir
in diesem Artikel die Entwicklung eines RPA-Assays für den Schnellnachweis von SARS-CoV-2 vor. Zusätzlich zum eigentlichen Assaydesign präsentieren wir auch einen neuartigen Ansatz für die Konstruktion von fluoreszenzmarkierten Oligonukleotidsonden für den Echtzeitnachweis der RPA.
Funktionsprinzip der recombinase polymerase amplification (RPA) Das grundlegende Funktionsprinzip der RPA ist dem natürlichen Replikationsmechanismus von Bakteriophage T4 nachempfunden (Abb. 1). Im ersten Schritt bindet das Enzym T4 UvsX (recombinase) mit T4 UvsY (loading factor) als Koenzym an die Primer. Dieser Nukleoproteinkomplex bindet unter Ausbildung einer Verdrängungsschleife (D-Loop, in Abb. 1C angedeutet) an die zum Primer komplementäre doppelsträngige Ziel-DNA. Nach der Hybridisierung löst sich UvsX vom Primer, während die geöffnete Verdrängungsschleife durch einzelstrangbindenende Proteine (T4
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