Protein-AMPylierungs-Identifikation in lebenden Zellen
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Posttranslationale Proteinmodifikationen
Protein-AMPylierungs-Identifikation in lebenden Zellen TOBIAS BECKER, PAVEL KIELKOWSKI DEPARTMENT CHEMIE, LMU MÜNCHEN
Protein AMPylation is a prevalent protein post-translational modification in human cells involved in endoplasmic reticulum stress regulation and neural development. In this article we describe the design, synthesis and application of a pronucleotide probe suitable for in situ fluorescence imaging and chemical protemics profiling of AMPylated proteins. Our probe utilizes straightforward strain-promoted azidealkyne click reaction for fluorescence labeling in living cells. DOI: 10.1007/s12268-020-1491-2 © Die Autoren 2020
ó Das menschliche Proteom ist um ein Vielfaches komplexer als das menschliche Genom. Ein Grund hierfür ist, dass Proteine mit bestimmten funktionellen Gruppen modifiziert werden, um ihre Aktivität, Lokalisierung und Interaktion mit anderen Proteinen zu regulieren [1]. Es gibt unterschiedlichste dieser posttranslationalen Modifikationen und eine Vielzahl von ihnen ist bereits gut erforscht. In diesem Artikel fokussieren wir uns auf eine posttranslationale Modifikation, der in jüngster Zeit immer größere Aufmerksamkeit zuteil wird: die AMPylierung [2, 3]. Charakteristisch für diese ist die Übertragung eines Adenosinmonophosphats (AMP) auf eine alkoholische Aminosäureseitenkette, wie Serin, Threonin oder Tyrosin. Diese Reaktion wird von AMP-Transferasen (AMPylatoren) katalysiert, die Adenosintriphosphat (ATP) als Ko-Substrat verwenden (Abb. 1A). Zur genaueren Untersuchung der AMPylierung wurden bereits unterschiedliche Methoden eingesetzt, wie etwa strukturell veränderte ATP-Analoga in Zelllysaten. Dies hat allerdings einen großen Nachteil: Die ATP-Analoga weisen aufgrund von Phosphatresten negative Ladungen auf, wodurch sie die Zellmembran nicht passieren können. Die Analyse der AMPylierung mit ATP-Analoga in lebenden Zellen ist aus diesem Grund nicht möglich. Um diese Problematik zu umgehen, entwickelte unsere Forschungsgruppe eine zellpermeable Sonde (proBIOspektrum | 07.20 | 26. Jahrgang
N6pA), die anstelle eines Triphosphats eine Phosphoramidatgruppe enthält (Abb. 1B, [4]). Die Zellpermeabilität basiert darauf, dass die Phosphoramidatgruppe im Gegensatz zur Triphosphatgruppe keine negative Ladung aufweist. Sobald die pro-N6pA-Sonde die Zellmembran passiert, wird sie metabolisch aktiviert, wodurch das aktive N6pATP entsteht. In der medizinischen Chemie ist diese Methode bereits weit verbreitet, etwa um antivirale Medikamente in die Zelle zu
transportieren, wie Sofosbuvir gegen Hepatitis C oder Remdesivir, dessen Wirksamkeit gegen das neuartige Coronavirus derzeit getestet wird [5]. Eine weitere Besonderheit der aktivierten N6pATP-Sonde ist ihre Alkingruppe, die sowohl eine Kopplung mit einem Affinitätstag als auch einem Fluoreszenzfarbstoff zulässt. Hierfür wird die „Click-Chemie“ verwendet, die schnell und bioorthogonal ist. Für diese Reaktion wird jedoch Kupfer(I) benötigt, das zytotoxisch ist und damit verhindert, dass AMPylierte Proteine auch
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