Single-particle tracking von GPCRs
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Methoden der Mikroskopie
Single-particle tracking von GPCRs SEBASTIAN FRANKEN 1 , HENDRIK BUSSMANN 1 , HANNS HÄBERLEIN 1 , ERIK BONKE 2 , CAROLINE END 2 1 INSTITUT FÜR BIOCHEMIE UND MOLEKULARBIOLOGIE, MEDIZINISCHE FAKULTÄT, UNIVERSITÄT BONN 2 PROMEGA GMBH, WALLDORF
Single-particle tracking (SPT) is a method of high-resolution microscopy to investigate the dynamics of single molecules inside cells or on the cell surface. Here we describe for the first time the applicability of the HiBiT Protein Tagging System combined with the HaloTag® self-labeling protein technology for monitoring the lateral diffusion of a pharmacological relevant G protein-coupled receptor (GPCR) by SPT. DOI: 10.1007/s12268-020-1400-8 © Promega GmbH 2020
ó Die laterale Diffusion eines G-Proteingekoppelten Rezeptors (GPCR) in der Plasmamembran bestimmt seine Interaktionsfähigkeit mit nachgeschalteten Signalmolekülen und moduliert in kritischem Maße seine Funktion [1]. Die Einzelpartikelverfolgung (single-particle tracking, SPT) in lebenden Zellen ist ein Schlüsselansatz, um die Funktion eines GPCRs in seiner natürlichen Umgebung direkt zu untersuchen. Mittels SPT werden detaillierte Informationen über die Rezeptorbeweglichkeit gewonnen, die insbesondere für die Beurteilung der pharmakolo-
gischen Wirksamkeit von potenziellen Wirkstoffen von Interesse sind. Üblicherweise werden für die SPT-Messung Rezeptoren in Fusion mit einem fluoreszenten Protein-Tag überexprimiert. Die Überexpression der markierten Rezeptoren in Kombination mit hochmolekularen Protein-Tags führt jedoch teilweise schon zur Rezeptoraggregation, was sich negativ auf SPT-Messungen auswirken kann. Zur Umgehung dieser Problematik haben wir im Rahmen einer Machbarkeitsstudie eine andere Nachweismethode basierend auf dem HiBiT-Protein-Tagging-System
[2] und der HaloTag-self-labeling proteinTechnologie [3] auf ihre Eignung für das SPT am Beispiel des β2-adrenergen Rezeptors getestet.
Das HiBiT-HaloTag-System HiBiT ist ein neuer, elf Aminosäuren langer Peptid-Tag, der zur Markierung von Proteinen für den Aufbau von sensitiven, biolumineszenten Proteinreporterassays eingesetzt wird. Der Nachweis erfolgt durch ein komplementäres Proteinfragment, Large BiT (LgBiT), das mit sehr hoher Affinität (KD = 700 pM) an das HiBiT-Peptid bindet. Durch die Komplementation HiBiT:LgBiT entsteht die enzymatische Aktivität einer Luciferase, die sich allerdings nicht direkt für SPT-Messungen nutzen lässt [2]. Jedoch stellt die Kombination des hochaffinen Detektionsprinzips des HiBiT durch LgBiT mit der fluoreszenten HaloTag-Technologie [3] eine Möglichkeit dar, den kleinen Peptid-Tag für die Rezeptorbewegung mittels SPT zu nutzen. Dafür wird ein aufgereinigtes LgBiT-HaloTag-Fusionsprotein in Kombination mit einem sehr hellen, fluoreszenten und photostabilen HaloTag-Liganden (Janelia Dye) verwendet (Abb. 1). Der fluoreszente Ligand bindet kovalent das HaloTag-Protein und ist geeignet für die hochauflösende Mikroskopie [4].
Experimenteller Aufbau des singleparticle tracking Di
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