Systemweite Anreicherung von RNA-Protein-Komplexen
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W I S S EN S CH AFT · ME TH ODE N
RNA-Protein-Wechselwirkung
Systemweite Anreicherung von RNA-Protein-Komplexen STEFAN PFISTER, BENEDIKT M. BECKMANN HU BERLIN, IRI LIFE SCIENCES
RNA-protein complexes (RNPs) are key players in cell physiology, especially in the context of RNA metabolism. However, their analysis has been dependent on specific protein epitopes or RNA sequence elements, preventing unbiased and cell-wide studies. We developed a three-step protocol, termed Phenol Toluol extraction (PTex), to isolate the complete suite of RNPs in cells, solely based on their unique physicochemical properties after UV-cross-linking. PTex, along with other recently developed unbiased techniques, has the potential to guide the way to cell-wide analysis of RNA-protein interactions. DOI: 10.1007/s12268-020-1465-4 © Die Autoren 2020
ó Für die zelluläre Genregulation sind Wechselwirkungen zwischen Ribonukleinsäuren (RNAs) und Proteinen essenziell. Vor allem die Rolle von RNA-Bindeproteinen (RBPs) – also Proteinen, die mit RNA interagieren – rückte in den letzten Jahren immer stärker in den Fokus. RBPs erfüllen zentrale Funktionen in der posttranskriptionellen Regulation sowie in der Genexpression, indem sie an Mechanismen wie Modifikation, Transport, Translation oder Abbau der RNA beteiligt sind. Dabei wurden neue Methoden entwickelt, die sich nicht auf einzelne RNA-Proteinkomplexe (Ribonukleoproteinkomplexe, RNPs) konzentrieren, sondern die Identifikation von RNA-Protein-Wechselwirkungen zellweit ermöglichen. Hunderte Proteine mit bislang unbekannter RNA-Bindeaktivität wurden somit gefunden [1, 2].
Systemweite RNA-Protein-Analytik Anders als bei Transkriptionsfaktoren oder anderen DNA-Bindeproteinen sind die Interaktionen zwischen RNA und Proteinen oft vorübergehend und hochdynamisch, sodass ein einzelnes RNA-Molekül von der Transkription bis zum Abbau mit einem ganzen Netzwerk aus RBPs wechselwirkt [3]. Eine oft verwendete Technik, um diese Interaktionen für eine Analyse zu stabilisieren, ist ein initiales Cross-Linking durch UV-Licht
(irreversibel) oder Formaldehyd (reversibel), das RNA und Protein über eine kovalente Bindung vernetzt und stringente Aufreinigungsprotokolle ermöglicht. Dies schaffte die Voraussetzungen für Methoden wie CLIP (cross-linking and immunoprecipitation), bei der RNAs, die an ein einzelnes Protein gebundenen sind, durch RNA-Sequenzierung systemweit identifiziert werden können. Im Rahmen des ENCODE-Projekts wurde dies für mehr als 350 RBPs systematisch durchgeführt [4]. Die Identifikation von neuen RBPs hingegen ist in den letzten Jahren hauptsächlich auf die RIC(RNA interactome capture)-Technik zurückzuführen. Hierbei können nach Anreicherung von mRNA die daran gebundenen Proteine durch Massenspektrometrie bestimmt werden [2]. Die genannten Methoden haben allerdings Einschränkungen. So benötigt der CLIPAnsatz einen vorhandenen Antikörper, der die spezifische Aufreinigung eines einzelnen Proteins und dessen gebundener RNA ermöglicht. Die RIC-Methode hingegen ist nur nur für polyadenylierte (eukaryotisc
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