miRNA-Detektion bei Osteoblasten
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Knochenbildung
miRNA-Detektion bei Osteoblasten SANDRA SCHNEIDER 1 , PETER BIBERTHALER 2 , MARC HANSCHEN 1,2 1 EXPERIMENTELLE UNFALLCHIRURGIE, KLINIKUM RECHTS DER ISAR, TU MÜNCHEN 2 KLINIK UND POLIKLINIK FÜR UNFALLCHIRURGIE, KLINIKUM RECHTS DER ISAR, TU MÜNCHEN
Micro-RNAs (miRNAs) have been getting more and more attention over the last few years due to their great potential as biomarkers for diagnostic approaches. miRNAs in bone are still not well explored and their influence on the gene expression is not completely understood by now. Some studies show that miRNAs have an impact on bone formation. Thus, the following work was looking at the expression level of miR-100-5p in osteoblasts as potential influencer of bone formation. DOI: 10.1007/s12268-020-1464-5 © Springer-Verlag GmbH 2020
ó Seit einigen Jahren gibt es durch die Entdeckung von mikroRNAs (miRNAs) neue Erkenntnisse in der DNA/RNA-Expression. Eine miRNA ist eine ungefähr 20 Nukleotide lange Sequenz, die nicht codierend ist. Diese scheint nach aktuellem Stand ubiquitär im menschlichen Körper vorzukommen und regulatorisch auf die mRNA und somit auf die Genexpression zu wirken. N. Ludwig und Mitarbeiter zeigten zusätzlich, dass gewebespezifische Unterschiede bei den miRNAExpressionsmustern vorhanden sind [1]. Sie gelten als endogene multitargeting-Moleküle und bieten so ein enormes Potenzial als Therapeutikum und Biomarker [2]. Gerade in der Krebsforschung zeigen miRNAs ihr Potenzial [3]. Erste tumorunterdrückende miRNA-Sequenzen, z. B. miR-34, miR-200 und miR-145, wurden detektiert und in präklinischen Studien getestet [3]. Darüber hinaus wurden auch miRNA-Sequenzen detektiert, die die Tumorentstehung begünstigen, z. B. miR-10b, miR-155 und miR-221 [3]. Als Therapieansatz in präklinischen Studien wurden bei diesen miRNAs inhibierende Sequenzen, die antimiRs, getestet [3]. Auch aktuelle klinische Studien mit miRNAs zur Behandlung von Hepatitis C oder ALS werden durchgeführt [2]. Weitere S tudien haben gezeigt, dass miRNA die Knochen bildung durch Osteoblasten beeinflusst [4]. Als Standardmethode zur Detektion von miRNA gilt die PolymeraseKettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR). Durch die Amplifikation können BIOspektrum | 06.20 | 26. Jahrgang
geringste Mengen zu Beginn eingesetzt werden.
miRNA-Isolation und PCR
20 μl Wasser (ultra-pure, Carl Roth GmbH und Co. KG, Karlsruhe) suspendiert. Die RNA-Bestimmung erfolgte mittels NanoDrop ND-1000 Spektrometer (ThermoFisher Scientific USA). Für die cDNA-Transkription wurde das miScript II RT Kit mit HiSpec Buffer nach Herstellerangaben verwendet (Qiagen N.V.). Für die qPCR wurde das miScript Primer Assay und 2x QuantiTect SYBR Green PCR zur Detektion von miR-100-5p und SNORD96a (als Referenzgen) verwendet (beides von Qiagen). Da die RNA-Konzentration und -Reinheit sehr gut waren, wurden transparente Low Profil 96-Well-Platten ohne Rahmen (BRAND GMBH + CO KG) für die PCR verwendet. Bei niedrigerer Konzentration oder Verunreinigungen stellen die weißen Platten eine Alternative dar. Diese erhöhen die Sensit
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